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qPCR可用引物验证---直接跑qPCR

2023-08-10 23:20:23 来源:哔哩哔哩

1. 为什么要做qPCR引物验证:节约时间以及试剂成本,避免做了大量样品结果分析时不可用;避免珍贵的样品被浪费,可以将引物验证好了再做;

2. qPCR引物验证的方法取普通的cDNA直接跑qPCR验证引物的可用性;普通梯度PCR+琼脂糖凝胶电泳验证引物的特异性;

3. qPCR预混反应体系(单一反应体系):


(资料图片仅供参考)

4. 上样:用排枪将预混液按15µL/孔准确加入96孔板中;然后用排枪准确加入5µL样本(制备的cDNA模板可稀释后使用),总反应体系为20µL;每个样本各设3个复孔;

5.cDNA原液50ng/ul,稀释10倍后,上样5ul(25ng);

6. 对照:引物对照(引物,Mix,H2O),阴性对照(水,Mix);

7. 待验证引物

一般从文献中找到之后,可以在NCBI中,先Primer Blast一下,看一下引物是否是特异性的,一般blast结果中显示是一个基因,或者是同一个基因的不同转录本,或者有别的基因出现,但product大于500bp以上,就表示该引物是特异性的,可以用;但如果有很多不同基因名的小片段(小于300bp),就表示不可用,可以排除了;

blast过的引物:

8. 板布局

9. 加样

10. 实验结果分析以及结果判读

Ø  根据qPCR结果中的CT值,水模板是否起峰;

Ø  扩增曲线,是否扩增,扩增曲线是否正常;

Ø  溶解曲线,是否为单一峰,是否为非特异性扩增;

:以上是我自己做qPCR之前会做的引物验证的实验流程,如果有帮助的话,算我没白敲,hhhh

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