qPCR可用引物验证---直接跑qPCR

1. 为什么要做qPCR引物验证：节约时间以及试剂成本，避免做了大量样品结果分析时不可用；避免珍贵的样品被浪费，可以将引物验证好了再做；

2. qPCR引物验证的方法：取普通的cDNA直接跑qPCR验证引物的可用性；普通梯度PCR+琼脂糖凝胶电泳验证引物的特异性；

3. qPCR预混反应体系（单一反应体系）：

(资料图片仅供参考)

4. 上样：用排枪将预混液按15µL/孔准确加入96孔板中；然后用排枪准确加入5µL样本（制备的cDNA模板可稀释后使用），总反应体系为20µL；每个样本各设3个复孔；

5.cDNA原液50ng/ul，稀释10倍后，上样5ul（25ng）;

6. 对照：引物对照（引物，Mix，H2O）,阴性对照（水，Mix）;

7. 待验证引物：

一般从文献中找到之后，可以在NCBI中，先Primer Blast一下，看一下引物是否是特异性的，一般blast结果中显示是一个基因，或者是同一个基因的不同转录本，或者有别的基因出现，但product大于500bp以上，就表示该引物是特异性的，可以用；但如果有很多不同基因名的小片段（小于300bp），就表示不可用，可以排除了；

blast过的引物：

8. 板布局：

9. 加样

10. 实验结果分析以及结果判读：

Ø  根据qPCR结果中的CT值，水模板是否起峰；

Ø  扩增曲线，是否扩增，扩增曲线是否正常；

Ø  溶解曲线，是否为单一峰，是否为非特异性扩增；

注：以上是我自己做qPCR之前会做的引物验证的实验流程，如果有帮助的话，算我没白敲，hhhh

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